言归正传，CHIP实验中会用到阴性对照引物，那么如何设计阴性对照引物呢？
经过仔细的思考，个人认为可能用到的会有两种类型的CHIP引物。这种引物只需要设计的引物不能扩增出CHIP实验设计时预计的转录因子或者组蛋白修饰的区域即可。因为CHIP实验本身主要研究的是启动子区相关的序列，所以CHIP引物设计时扩增的目的序列为基因组序列。因此阴性对照引物设计只要保证不扩增出基因组序列即可。此时有一个简单而方便的引物可供选择，即在研究目的基因时设计的检测基因表达量的QPCR引物即可满足该要求，前提条件是该QPCR引物需要设计时跨外显子。这样即可保证该引物不能扩增出任何基因组的序列。那如果需要设计基因组上的阴性对照引物该如何设计呢？参考下图，如果在CHIP-seq实验中，c-myc对PFK的调控为转录性刺激修饰，也即我们常说的c-myc为PFK的转录因子。那么当用c-myc的抗体做CHIP实验，然后进行CHIP-seq那么seq的结果中理论上应该有c-myc作用于PFK启动子区的序列。那么我们可以根据c-myc的结合位点，避开其结合位点在PFK启动子区设计该CHIP实验的阴性对照引物。2.根据实验设计需要设置的相关通路中的阴性对照引物仍然参考上图，在该通路中c-myc为PFK的转录因子，而c-myc不是PKM2的转录因子。那么当研究该通路时，当用c-myc的抗体做CHIP实验，然后进行CHIP-seq那么seq的结果中理论上应该有c-myc作用于PFK启动子区的序列，而不应该有PKM2启动子区的序列。所以该实验即可设计PKM2启动子区的CHIP引物作为该实验的阴性对照引物。以上分析仅仅针对转录因子直接作用于下游基因启动子区的情况，对于更复杂的转录因子结合情况需要根据具体实验和研究通路进行分析。
